METAFLORE : La technique au cœur du projet (2/3) - Biova

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L’avènement des outils de la biologie moléculaire qui se basent sur l’analyse des séquences d’Acide DésoxyriboNucléique (ADN) a permis une amélioration de la recherche de bio-agresseurs particuliers. La PCR (Polymerase Chain Reaction) puis la qPCR (quantitative PCR) ont permis de franchir des caps en termes de sensibilité et de spécificité. Grâce à ces outils, une très faible quantité de pathogènes peut être détectée précisément, rapidement et sans recours à des méthodes de culture qui peuvent introduire des biais.

 

Les analyses PCR et qPCR ne trouvent que ce qui est recherché. En effet, c’est en amplifiant une région spécifique d’un bio-agresseur particulier que l’on détecte ce dernier. Si on souhaite rechercher 5 bio-agresseurs particuliers, il faut amplifier les 5 séquences spécifiques, etc. La mise au point de chaque amplification spécifique est délicate, la mise au point et la validation d’une PCR pour chaque bio-agresseur connu à ce jour prend beaucoup de temps et ne permet pas de détecter à posteriori un bio-agresseur émergent.

 

La technologie qui permet de lever cette limitation est le séquençage . Cette technologie connait des développements rapides depuis l’invention de la première génération de séquenceurs (1977).
La seconde génération de séquenceurs est apparue en 2005 et des constructeurs différents ont proposés des principes de fonctionnement distincts. La différence avec la première génération est l’absence d’une étape préalable de clonage des séquences à déterminer dans des constructions génétiques permettant leur amplification. La suppression de cette étape de clonage a permis une réduction drastique du temps de séquençage et une baisse des coûts selon un rythme plus élevé que ce que prévoit la loi de Moore.
La troisième et dernière génération de séquenceurs implique le séquençage de molécules uniques c’est-à-dire sans amplification par PCR des séquences analysées avant le séquençage comme on le faisait avec les séquenceurs de seconde génération. La suppression de cette étape contribuera aussi à la baisse du prix des analyses par séquençage.

 

Ainsi, le séquençage apparait aujourd’hui comme une alternative avantageuse aux méthodes de culture qui permettaient de détecter un nombre relativement important de micro-organismes et aux méthodes de PCR qui ciblent uniquement les micro-organismes recherchés à-priori. Dans un domaine proche des analyses sanitaires sur semences, nous pouvons citer l’essor de la médecine personnelle qui s’appuie sur le séquençage du génome d’individus, preuve de l’intérêt croissant pour le séquençage dans le domaine du diagnostic.

 

En ce qui concerne l’analyse des communautés microbiennes des semences de plantes, des travaux existent et se basent sur une approche méta-génomique par séquençage. Dans ces travaux, les bactéries et les champignons présents sur des semences de plantes ont été identifiés par le séquençage de séquences communes à tous les champignons ou bactéries mais spécifiques de chaque espèce ou genres.

 

En effet, la reconnaissance d’un organisme par séquençage est réalisée par comparaison d’une partie de son génome séquencée avec une séquence correspondante présente dans une base de données. L’analyse phylogénétique des bactéries se fait couramment par l’analyse de l’ADN codant pour l’ARN 16S du ribosome et celle des champignons, oomycètes et nématodes se fait, par exemple, en comparaison avec l’ADN codant pour l’ARN 18S du ribosome.

 

Une synthèse récente traitant des avancées du séquençage haut-débit pour l’analyse des communautés de champignons vient de paraitre en 2018 . En ce qui concerne les champignons parasites des plantes, il est mentionné « des diagnostics moléculaires sont disponibles mais n’utilisent pas le séquençage haut-débit et ils sont limités à quelques pathogènes affectant les cultures les plus importantes ». C’est effectivement le cas des travaux mentionnés dans la partie précédente pour les méthodes ANSES et la norme PM7/129 de l’OEPP. En conclusion de l’article, les auteurs notent aussi que « le meta-barcoding des champignons est une approche inter-disciplinaire [..] les équipes travaillant sur de tels projets devraient être composées avec des expertises en mycologie, science naturelle, bio-informatique, … ».

 

Sources:

  • Ali Masoudi-Nejad, Zahra Narimani, Nazanin Hosseinkhan, Next Generation Sequencing and Sequence Assembly - Methodologies and Algorithms, Springer, 2013
  • Simultaneous profiling of seed-associated bacteria and fungi reveals antagonistic interactions between microorganisms within a shared epiphytic microbiome on Triticum and Brassica seeds., Links M.G. et al., New Phytol. 2014 Apr;202(2):542-53
  • Emergence Shapes the Structure of the Seed Microbiota, Matthieu Barret et al., Appl Environ Microbiol. 2015 Feb; 81(4): 1257–1266
  • R. Henrik Nilsson and Al., Mycobiome diversity: high-throughput sequencing and identification of fungi, Nature Reviews Microbiology (2018)

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